|
АлАТ - аланинаминотрансфераза
АО - антиоксидант
АОС - антиоксидантная система
АсАТ - аспартатаминотрансфераза
АФК - активная форма кислорода
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
ДК - диеновый конъюгат
ЛДГ - лактатдегидрогеназа
МПО - миелопероксидаза
НСТ - нитросиний тетразоль
ОГБГ - острая гипобарическая гипоксия
ПААГ - полиакриламидный гель
ПОЛ - перекисное окисление липидов
СОД - супероксиддисмутаза
СР - свободные радикалы
СРО - свободно радикальное окисление
ФАОС - физиологическая антиоксидантная система
ФС - фармакопейная статья
ФСП - фармакопейная статья предприятия
ХЛ - хемилюминисценция
ЦП - церулоплазмин
Imax - максимальная интенсивность хемилюминисценции
ВВЕДЕНИЕ
Последние годы характеризуется возрастанием интереса к мультимедийной оксидазе - церулоплазмину. Установлена его структура. Определена роль ионов меди в ферментативном процессе (Hellman N. et al., 2002; Va-chette P. et al., 2002). Показано, что ЦП окисляет токсические формы железа и переводит их в нетоксические, защищая ткани от повреждения их свободными радикалами. На протяжении многих лет ЦП успешно применяли в послеоперационном лечении онкологических больных. Введение ЦП оказывало нормализующее действие на окислительно-антиокислительный баланс (Н.В. Эделева с соавт., 1997; Н.В. Эделева с соавт.,2001).
В настоящее время полагают, что антиоксидантный эффект ЦП может быть важным при лечении различных нейродегенеративных заболеваний, таких как болезнь Паркинсона и Альцгеймера (Patel В. N. et al., 2002). Обнаружена группа наследственных заболеваний - ацерулоплазминемия. У больных с ацерулоплазминемией отмечено накопление железа в тканях, включая печень, поджелудочную железу и мозг, которое стимулирует производство свободных радикалов кислорода и вызывает повреждение тканей. Церулоплазмин уменьшает эту способность (Takeuchi Y.et al., 2002).
Существует вероятность, что ЦП как антиоксидант может быть полезен при явлениях гипоксии - реоксигенации, связанных с окислительными стрессами. В экспериментах на животных показано, что повреждения, вызванные гипоксией и реоксигенацией могут быть уменьшены введением ряда ферментов, контролирующих этот процесс (Horakova, L. et al. 1997).
Расширение спектра применения препарата сдерживается небольшими объемами его производства. Ведутся поиски различных источников получения ЦП, включая создание рекомбинантных форм фермента (Bielli P. et al., 2001). Большинство производителей для получения ЦП используют фракцию III, хотя выход фермента не превышает 5-8 доз с одного килограмма осадка. Для повышения производства препарата необходимо расширить поиск дру-
гих источников сырья. Ранее предпринимались попытки выделить ЦП из фракций, образующихся в процессе спиртово-каприлатного способа получения альбумина (А.Г. Исрафилов, 1993), но они оказались неудачными. Несмотря на многолетний опыт выделения фермента, остаются также нере-шенными ряд проблем, связанными с методом получения - повреждениями структуры и потерей ферментативной активности в процессе производства и хранения.
Поэтому поиск новых источников сырья и разработка условий стабилизации ЦП является важнейшей научно-производственной задачей.
Цель исследования
Разработка технологии получения стабильного церулоплазмина из фракции плазмы крови IV-I Кона и оценка его свойств в эксперименте и клинике.
Задачи исследования
1. Провести сравнительную оценку содержания фермента в неиспользуемых фракциях спиртового метода при производстве иммуноглобулинов и альбумина.
2. Разработать технологию получения стабильного высокоочищенного препарата из фракции IV-I Кона и оценить изменения параметров лекарственного средства в процессе производства и хранения.
3. Изучить фармакокинетику препарата при введении экспериментальным животным.
4. Исследовать влияние церулоплазмина на экспериментальных живот-0 ных в условиях гипобарической гипоксии.
5. Изучить влияние ЦП на биохимические показатели у больных с острым деструктивным панкреатитом.
Научная новизна
Разработан метод получения ЦП, включающий избирательную денатурацию балластных белков фракции IV-I при рН 5,6-5,7 и температуре 60°С, адсорбцию фермента из раствора на ДЕАЕ-сефадексе А-50, элюцию ЦП с анионообменника при данном рН с последующей его очисткой хлороформом и концентрированием этанолом. На новые элементы технологии получен патент на изобретение №2162338.27.01.2001.
Установлено, что изменение физико-химических свойств и оксидазной активности ЦП на этапах лиофилизации и в процессе хранения связаны с превращением голо-ЦП в апо-ЦП и полимеризацей апо-ЦП.
Разработан новый способ стабилизации голо-ЦП посредством добавления в препарат маннитола.
Впервые продемонстрирован антигипоксический эффект ЦП на модели гипобарической гипоксии. Показано, что антигипоксический эффект отмечается, как при внутривенном, так и при внутримышечном введении.
Впервые показано, что ЦП способствует нормализации параметров воспалительного ответа и показателей эндогенной интоксикации при панкрео-некрозах.
Практическая значимость
Технология получения ЦП из фракции плазмы крови IV-I Кона внедрена на Нижегородском государственном предприятии - фирме «Имбио». По материалам настоящей диссертационной работы разработан промышленный регламент на препарат церулоплазмин лиофилизированный для инъекций №01898718-30-2000, согласованный с Гематологическим научным центром РАМН.
В экспериментах на животных установлен факт поступления в кровяное русло ЦП при внутримышечном введении с сохранением ферментативной активности, что свидетельствует о возможности внутримышечного введения препарата.
8
Установлено, что введение ЦП больным острым деструктивным панкреатитом снижает эндогенную интоксикацию организма, что может явиться основанием применения препарата при данном заболевании.
Основные положения, выносимые на защиту:
1. Технология получения ЦП из фракции плазмы крови IV-I Кона, состав и свойства препарата.
2. Антигипоксический эффект ЦП проявляется как при внутривенном, так и при внутримышечном введении.
3. ЦП корректор эндогенной интоксикации у больных острым деструктивным панкреатитом.
ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 1.1. Биохимическая характеристика церулоплазмина
Церулоплазмин (ЦП) - белок плазмы крови человека с электрофоретиче-ской подвижностью альфа2-глобулинов. Был впервые описан и выделен в чистом виде Holmberg в 1948 г. По современной классификации ЦП является медьсодержащей оксидазой (КФ. 1.16.3.1), участвующей в транспорте меди, реакциях острой фазы воспаления и стресса, нейроэндокринной регуляции и поддержке кроветворения (О.Л. Санина с соавт., 1986). Особый интерес вызвало обнаружение антиоксидантных и радиопротекторных свойств церулоплазмина (А.Н. Ярополов 1986; Dormandy 1981; Dumoulin et al., 1996).
ЦП - сывороточный гликопротеин, представленный одной полипептидной цепью, углеводный компонент (2-8 % от массы молекулы) включает 9 олигосахаридных цепей, содержащих глюкозамин (15,7-19,2 %), маннозу (14,2 %), галактозу (12,3 %), фукозу (1,6 %) и сиаловые кислоты (8,6 %) (Ry-den, 1982). Медь составляет 0,27 -0,32 % от всей массы белка (Laurie et al., 1980).
С помощью ЭПР-спектроскопии было установлено, что молекула ЦП содержит 6 ионов меди, представленных 3-мя типами. Ионы меди I типа характеризуются сильным поглощением в области около 600 нм (максимум поглощения ЦП находится при 610 нм), из-за чего белки, их содержащие, приобретают интенсивную голубую окраску (Lindley et al., 1997). Ион меди I типа имеет в качестве обязательных лигандов два атома азота имидазольного кольца гистидина и атом серы цистеина. Как правило, в качестве четвертого лиганда выступает еще один атом серы метионина. Весь центр связывания Си+2 I типа имеет форму неправильного тетраэдра, что, вероятно, является компромиссом между формой полноценного тетраэдра, характерной для Си+, и квадратно-плоскостной координацией Си+2 в составе низкомолекулярных
10
комплексов меди или неголубых медьпротеидов (Lu et al., 1983). Скорее всего, требуя наименьших энергетических затрат на реорганизацию центра, такая форма обеспечивает необычайно быстрые переходы иона меди I типа из одного состояния окисления в другое и обратно, что, в свою очередь, дает голубым белкам возможность эффективно участвовать в реакциях переноса электронов. Спектральные характеристики ионов Си II типа, входящих в состав белков, близки к таковым у низкомолекулярных комплексов меди, имеющим бледно-голубое окрашивание, благодаря d-d переходам в области 600-800 нм спектра поглощения Си+2. После получения четкого сигнала ЭПР стало ясно, что в роли лигандов иона меди II типа в белках выступают четыре атома азота имидазольных колец гистидина (Dawson et al., 1979). В пользу имидазольного лигандирования Си"1"2 II типа говорят и результаты исследований этого иона методом спинового эха (Mondovi et al.,1977).
В отличие от Си+2 II типа, ионы меди III типа имеют ряд специфических спектральных характеристик, что вызвано особенностями их лигандирования. Эти ионы существуют в виде пар, расстояние между ионами обычно находится в пределах 0,34-0,45 нм (Brown et al.,1980), так что неспаренные электроны внешнего уровня имеют взаимно компенсированные спины. Поэтому в своем обычном состоянии Си+2 III типа не дают вклада в спектр ЭПР. Они, имеют характерную полосу поглощения, максимум которой приходит-ся на 330-340 нм (Beltramini et al.,1990). Как и Си II типа, ионы меди III типа лигандируготся атомами азота имидазолов гистидина. Для образования центра связывания ионов меди III типа белковая глобула должна иметь своеобразный гистидиновый кластер, в котором неоднократно встречается последовательность Гис-Х-Гис (Messerschmidt, Huber, 1990). Три из них - ионы "голубой" меди, один - Си+2 II типа, оставшиеся два составляют диамагнитный центр III типа. (Ryden, 1982). Удаление ионов меди из голо-фермента ведет к высвобождению гидрофобных участков, которые, по-видимому, участвуют в формировании активного центра молекулы (В.Б. Васильев с со-
11
авт., 1996; De Filippis et al., 1996). Кроме того, лигандами меди являются SH-группы цистеина, атомы азота, остатки гистидина и метионина.
Предполагается, что для формирования активного центра необходимы
только 4 из 6 атомов меди (Н.В. Цымбаленко с соавт.,1997).
Ф
Молекулярная масса ЦП, равна 130-138 кД (Neel, 1979; Manolis et al.,
1980; Kingston et al., 1980; Calabrese et al., 1981; Sato et al.,1990).
Ранее предполагали, что печень - основной источник ЦП в организме. Однако в последствие было установлено, что многие ткани также способны его вырабатывать. Обнаружена экспрессия гена ЦП в лимфоцитах (Pan et al.,1996), мононуклеарных клетках селезенки (B.C. Гайцхоки с соавт.,1990), ткани мозга (Klomp et al., 1996), бронхов (Yang et al., 1996), матки (Thomas et al.,1995), в синовиальной оболочке суставов (Gitlin et al., 1977). Так, например, ЦП обнаруживали на всем протяжении воздухоносных путей и в альвеолах (Yang et al., 1996); причем при воспалении его уровень в клетках бронхиального эпителия, особенно крупных бронхов, резко возрастал. Тот факт, что ЦП синтезируется столь многими тканями, свидетельствует о необходимости ТТЛ для их жизнедеятельности.
Среди многообразных функций ЦП в настоящее время могут быть выделены: 1) транспорт меди; 2) участие в метаболизме железа; 3) антиокси-дантное действие, ингибирование перекисного окисления липидов; 4) участие в реакциях острой фазы; 5) регуляция биогенных аминов в организме (О.Л. Санина с соавт., 1986). Далее мы рассмотрим эти функции подробнее.
Церулоплазмин и метаболизм меди в организме
^ Медь - это необходимый элемент для многих биологических процес-
сов. Его функциональный диапазон распространяется от влияния на экспрессию специфических генов до участия в построении кофакторных и специфических групп медь-зависимых ферментов. Медь необходима для роста организма, нормального функционирования иммунной системы, созревания клеток крови, метаболизма глюкозы и холестерина, развития и
12
функционирования мозговой ткани, сокращения миокарда (Wildman et al., 1995;Olivaresetal., 1996).
Дефицит меди наблюдается главным образом у детей, может быть наследственно обусловленным или приобретенным. Основные симптомы недостаточности меди - анемия, нейтропении, аномалии костей, реже - гипо-пигментация волос, гипотония, задержка роста, снижение сопротивляемости организма инфекциям, повреждение фагоцитарной способности нейтрофи-лов, нарушение метаболизма глюкозы и холестерина, кардиоваскулярные поражения (Atanasiu et al., 1996; Olivares et al., 1996).
Недостаток меди изменяет острофазный ответ нейтрофилов на вирусную инфекцию и может влиять на ответ макрофагов на стимуляцию митоге-нами (Arthington et al., 1996). Установлено, что потребность организма в меди значительно возрастает при развитии воспаления (Koh et al., 1996)..
4
Доказана необходимость меди для нормального течения эмбриогенеза.
Перинатальный дефицит меди у животных приводит к долговременным нейрохимическим и поведенческим отклонениям (Prohaska et al., 1996). Эффекты, связанные с недостатком меди в организме, могут быть обусловлены инактивацией металлоферментов (Sorenson et al., 1995), аминооксидаз, аскорбатоксидаз, супероксиддисмутаз, изменением липидного обмена, и активности генетического аппарата клетки.
Таким образом, поступление меди необходимо для организма. Оптимальным источником меди являются её комплексы с белками. Существуют заболевания, связанные с нарушением выработки ЦП, и соответственно, §г изменением метаболизма меди: синдром Вильсона-Коновалова, синдром
Менкеса, наследственная ацерулоплазминемия (Takeuchi et al., 2002). При этих заболеваниях отмечается отложение избыточного количества железа и меди в некоторых тканях, что ведет к нарушению деятельности центральной нервной системы, печени, поджелудочной железы. Это свидетель-
13
ствует о необходимости регуляции уровня меди и важной роли церулоплаз-мина в этом процессе (Shimizu et al., 1999).
Медь, требующаяся для поддержания метаболических процессов, в отличие от аминокислот, липидов или жирных кислот, не может быть синте-
W
зирована de novo. Концентрация их в тканях может понижаться в связи с неадекватным поступлением и адсорбцией. (Wapnir, Devas,1995). Предполагаемое количество ионов меди в плазме является крайне низким (1СГ18 моль/л), и не поддаётся определению. Вероятно, ее концентрация в тканях остается такой же низкой. Соответственно, измеряемые концентрации меди, также как и других металлов в тканях, отражают количество лигандов, преимущественно металло-зависимых ферментов и таких белков, как церуло-плазмин, а также жирных кислот, аминокислот и других биологических веществ (Wan et al., 1996). Усваиваемая пища уже содержит металлоэлементы в связанной форме. Обычно происходит преобразование этих соединений, однако, некоторые из них не претерпевают изменений. Поступление меди в дозах, превышающих физиологические, в норме регулируется гомеостати-ческими механизмами (Sorenson et al., 1995). Ионные формы меди, как и прочих металлоэлементов, обладают высоким аффинитетом к органическим лигандам, найденным в биологических системах, и быстро образуют комплексы с ними. Абсорбированные хелаты меди поступают в циркуляцию и усваиваются всеми тканями, что сопровождается лигандным обменом с низкомолекулярными соединениями, апопротеинами и апоферментами, до формирования металлопротеинов и металлоферментов в синтезе de novo (рис.1)
#¦, (Н.В. Цымбаленко с соавт.,1997). Церулоплазмин, альбумин, транскупреин
и, в какой-то степени, некоторые аминокислоты, являются главными переносчиками меди в плазме. После их включения в печень медь хранится в ге-патоцитах, или поступает в плазму и желчь. Содержащаяся в тканях медь высвобождается в виде хелатов через лигандный обмен, до достижения нормального метаболического уровня (Н.В. Цымбаленко с соавт.,1997).
14
авт., 1997). Высвобождение больших количеств меди при ее усиленной мобилизации в случае острых и хронических заболеваний является интерлей-кин-1-зависимым (Sorenson et al.} 1995). Вероятно, уровень ответа адекватен у нормальных, хорошо приспособленных индивидуумов. Однако в настоя-щее время признано, что уровень диетического поступления меди, железа, цинка и вероятно, марганца зачастую оказывается меньше рекомендуемого (Wright et al.,1991). Лица, имеющие ограниченный запас этих элементов, тяжелее переносят заболевания. Не наблюдалось заболеваний, вызванных избыточным поступлением металлоэлементов. Существует верхний предел концентрации меди, диктуемый физиологическими условиями, поскольку накопление избыточной меди нежелательно для организма. Например, было показано, что в культуре in vitro Cu 2+ повреждает клетки и вызывает экспрессию тканевого прокоагулянтного фактора, что в конечном итоге, in vivo может привести к развитию внутрисосудистого свертывания крови (Crutchley, Que 1995). Этот эффект, наблюдаемый только в присутствии липофильного хелатирующего агента, подавляется ЦП (С.Г.Антоненко 1985; De Filippis et al., 1996). Медь, находящаяся в гепатоцитах, связывается со специфическими белками, в первую очередь, с металлотионеином, или включается в некоторые ферменты. Было показано, что включение меди в металлотионеин и другие белки требует предварительного связывания с глютатионом; этот процесс является АТФ-зависимым (Luza, 1996). Концентрация металлотионеина в печени изменяется в зависимости от поступления меди с пищей. Связывание меди с металлотионеином позволяет осущест- вить временное хранение меди в цитоплазме, защищая ткани от ее воздействия. Металлотионеин, проявляющий высокую реактивность по отношению к перекисным радикалам, играет защитную роль против медь-индуцированной цитотоксичности. До включения в состав ЦП медь связывается с промежуточным внутриклеточным ЦП - подобным белком (Luza, 1996).
15
В состав ЦП входит 90-95% меди, содержащейся в плазме крови (Harris, 1993). Синтезируемый печенью ЦП разносится по тканям организма и поставляет ионы меди клеткам.
Недавно было установлено, что церулоплазмин может вырабатываться и другими тканями и органами (Thomas et al., 1995; Klomp et al., 1996; Yang et al., 1996). Характерно, что усиление синтеза ЦП в этих тканях происходит при различных патологических процессах, где возрастает потребность в ЦП (Levin, Geszvain, 1998).
Клетки организма, в частности, фибробласты, связывают только натив-ный ЦП, в свою очередь, гепатоциты избирательно связывают и поглощают только те молекулы ЦП, которые предварительно были экскретированы другими тканями организма (Л.В. Пучкова с соавт.,1997).
ЦП после связывания со специфическим рецептором на поверхности клеток организма и передачи этим клеткам части ионов меди подвергается интернализации с помощью рецептор опосредованного эндоцитоза (Hilton et al., 1995). При этом пептидная часть молекулы ЦП, прочно связанная с медью, при трансклеточном переносе теряет остатки сиаловых кислот и освобождается в кровоток (Ryden,1984). Расположенный на плазматической мембране гепатоцитов рецептор сиаловых гликопротеинов способен распознавать десиалированный ЦП. Это позволяет гепатоцитам поглощать данную форму ЦП, и возможно, выводить прочно связанную с ним медь в желчь (Iyenden et al., 1988; Verbina et al., 1992). Кроме того, выведению ЦП в желчь способствует и то, что при удалении ионов меди из молекулы ЦП происходит высвобождение её гидрофобных участков (С.Г. Антоненко с со-авт.,1985; De Filippis et al., 1996).
16
(Си) (Си) (Cu) (Cu)
Клетки различных тканей организма
Желчь
Пищеварительный
Кровоток
ЦП гепато-цитов
Си
._*
Сывороточный ЦП
Сцеруло-гА^плазмин
Си.
Асиало-ЦП
ЦП гепато-цитов
ЦП желчи
Фекалии
выведение белков
передача ионов меди
Рис. 1. Схема метаболизма меди в организме.
17
Было обнаружено 3 молекулярные формы РНК, кодирующие 3 изофор-мыЦП:
1) нативная форма ЦП, присутствующая в сыворотке (м.м. 132 кД);
2) ЦП желчи, (м.м.200 кД);
3) внутриклеточный несекретируемый ЦП - подобный белок (м.м. 50 кД).
Желчь - главный путь выведения меди из организма. Гибкая система регуляции уровня меди в плазме позволяет выводить из организма излишки меди в составе желчи уже через 30 мин после введения (Л.В. Пучкова с со-авт., 1993). Ключевую роль в этом процессе играет церулоплазмин. Нарушения, возникающие в системе метаболизма меди, являются причиной патологических процессов, в основном связанных с токсическим действием меди.
Ярким примером этого является наследственное заболевание - гепато-лентикулярная дегенерация (Синдром Вильсона-Коновалова). Ранее полагали, что развитие заболевания обусловлено нарушением синтеза ЦП печенью. Это подтверждал низкий уровень фермента в плазме больных. Первые попытки лечебного применения ЦП были проведены именно при этом заболевании, и при этом не наблюдалось никакого положительного эффект. Впоследствии было установлено, что нарушен не синтез ЦП, а механизм его экскреции из тканей (Davis et al.,1996). Избыточное накопление ЦП и связанной с ним меди вызывало поражение печени и других тканей и органов, в которых он синтезировался. Таким образом, это явилось подтверждением важной роли ЦП в метаболизме меди - не только своевременного предоставления ф меди тканям, но и выведения излишнего количества из клеток.
Таблица 1 содержит перечень медь-зависимых ферментов и свидетельствует о том, что ЦП необходим также для поддержания деятельности различных ферментов антиокислительной системы, процессов заживления ран. Представленные ниже данные клинических испытаний препарата ЦП подтверждают это.
|